Alan W. Walker, Lesley Hoyles
За последние двадцать наблюдается существенный рост исследований микробиома человека и каждый год публикуются тысячи работ, посвященных этой теме. Уже потрачено огромное количество денег на изучение микробиома человека, как причины или потенциальной терапевтической цели при множестве заболеваний, включая воспалительные заболевания кишечника и кардиометаболические состояния. Несмотря на этот очень захватывающий процесс научного познания, здесь есть и обратная сторона, когда повышенное внимание к микробиому принесло с собой ненужный ажиотаж и укоренило определенные заблуждения. И как результат, множество неподтвержденных или недостаточно подтвержденных заявлений становятся «фактом», благодаря постоянному повторению. Некоторые из них более распространены, чем другие, но в совокупности они лишь подчеркивают широкое распространение дезинформации в литературе, посвященной микробиому человека. Нашу задачу мы видим в прояснении устойчивых мифов (или новых мифов), касающихся микробиома человека, указывая на фактические неточности. Мы начинаем с относительно незначительных, но показательных моментов, после чего мы переходим к вопросам, имеющим большое потенциальное воздействие. Мы целенаправленно старались избежать ненужного указания пальцем на оригинальные источники ошибочной информации, а вместо этого храним надежду, что наше видение и критическая оценка будут очень полезными на этом относительно новом поле научных исследований.
“Микробиом — абсолютно новая область исследований”
Действительно, темпы изучения микробиома человека ускорились за последние 15 лет, но эта область исследований и ранее не находилась в зачаточном состоянии. Более того, утверждения такого рода пренебрегают тем фактом, что еще до момента изобретения методов секвенирования ДНК были проведены великолепные исследования в области изучения микроорганизмов, ассоциированных с человеком, начиная с 19 века. Escherichia coli была впервые выделена в 1885 году [1], бифидобактерия была описана в 1899 году [2], а Мечников первым предположил важность и полезность микроорганизмов кишечника в начале 1990-х [3]. Аналогичным образом концепция оси «кишечник-головной мозг» изучается в течение веков [4], а о влиянии на здоровье ключевых микробиом-ассоциированных метаболитов, таких как короткоцепочечные жирные кислоты, было сообщено более 40 лет назад [5].
“Джошуа Ледерберг (Joshua Lederberg) первым придумал термин микробиом”
Действительно, лауреат Нобелевской премии Джошуа Ледерберг достиг многого в своей карьере, но не он создал термин «микробиом». Имеются доказательств того, что это слово в его современном значении использовалось задолго до того, как Джошуа Ледерберг впервые его использовал в 2001 году [6]. Несмотря на относительную тривиальность, этот миф служит примером того, как легко ложь внедряется в литературу вообще и в литературу, посвященную микробиому человека, в частности.
«В каждом грамме человеческих фекалий содержится 1012 бактериальных клеток»
Это утверждение очень часто упоминается в литературе по микробиому, но источник установить очень трудно. Скорее всего такое количество клеток было получено из сухих, а не влажных фекалий. Но как бы это ни было, это неверно. Реальная цифра, что была установлена с помощью различных методов (прямой подсчет клеток, проточная цитометрия, количественная полимеразная цепная реакция, др.), находится в пределах 1010–1011 микробных клеток на каждый грамм влажных фекалий [7-9].
“Микробиота человека весит от 1 до 2 кг”
Несмотря на то, что это утверждение кочует по литературе, очень часто это утверждение не сопровождается ссылкой и для нас было невозможно найти оригинальный источник этого утверждения. Тем не менее, вряд ли это утверждение правдиво в большинстве случаев. Большая часть микробиоты человека содержится в кишечнике и на долю этих микроорганизмов приходится менее половины от общей массы твердых фекалий [10]. В среднем масса стула человека составляет менее 200 г (жидкий вес) [11], а общая масса колонизирующих микроорганизмов находится в пределах от 83 до 421 г, что было показано в небольших исследованиях на внезапно погибших жертвах [12]. Таким образом, за исключением людей с тяжело протекающими запорами и чрезвычайно уплотненными фекалиями в их кишечнике, общий вес микробиоты человека вероятнее всего составляет не более 500 г, а в некоторых случаях и меньше.
“Численность микробиоты превышает численность человеческих клеток как 10:1”
Этот миф, пожалуй, самый распространенный в литературе, посвященной микробиому человека и мы, к сожалению, в прошлом часто им пользовались (мы, как и все, не имеем иммунитета к мифологии). Прекрасное исследование [10] показало, что этот миф ведет свое начало из 1970-х и связан с ошибкой в расчетах. Более детальный анализ показал, что это соотношение более близко к 1:1. Здесь следует отметить, что это соотношение может варьироваться от человека к человеку и зависит от таких факторов, как размер тела и количество фекального материала, что микроорганизмы вырабатывают в кишечнике [13]. Сегодняшние оценки в большей степени основываются на наблюдениях взрослых людей, живущих в урбанизированном пространстве в высоко развитых странах. Более точные оценки потребуют проведения исследований на людях, живущих в других условиях.
«Микробиота наследуется от матери при рождении»
В большей части это утверждение можно встретить в научно-популярной литературе, чем в строго научной литературе, но это утверждение объясняет, какую важность имеют нюансы при описании микробиома человека. Несмотря на то, что некоторые микроорганизмы напрямую переходят от матери к новорожденному во время родов [14, 15], пропорционально лишь небольшое количество микроорганизмов действительно «наследуется» и существует от рождения до взрослой жизни [15, 16]. Но в действительности большое разнообразие микробиоты кишечника достигается после отлучения от грудного вскармливания [17] (Рис.1). В итоге, каждый взрослый приобретает уникальную конфигурацию микробиоты, даже близнецы, что росли в идентичных условиях [18]. Таким образом несмотря на то, что структура микробиоты до конца не выяснена, сообщества микроорганизмов формируются под воздействием стохастических воздействий окружающей среды, — диета, терапия антибиотиками, генетика, — так что прямое наследование от матери играет очень незначительную роль.
«Большинство заболеваний характеризуется патобиомом»
Утверждение о том, что большинство заболеваний вызвано патобиомом, распространяется лавинообразно, не исключая и научную литературу. В широком смысле это определяется нарушением взаимодействия между микробными сообществами и организмом хозяина, что ведет к развитию заболевания. К сожалению, это утверждение чрезмерно упрощено и по своей сути ошибочно. Микроорганизмы и их метаболиты не могут быть «хорошими» или «плохими», они просто существуют. Их влияние на нас, как на хозяина, в очень большой степени зависит от контекста. К примеру, Clostridioides difficile может не проявлять себя в течение всей жизни хозяина, но при возникновении таких проблем, как старение, компроментирование иммунной системы и лечение антибиотиками, этот микроорганизм вызывает заболевание [19]. Подобным образом, E. coli может в кишечнике может быть безвредной, но вызывать инфекции мочевого тракта при проникновении в уретру [20]. Как результат, термин «патобиом» остается расплывчатым и лишенным точности, необходимой для клинической практика, а значит бесполезным. Правдиво и то, что при нескольких состояниях у человека показано, что их развитие коррелирует с нарушениями состава микробиоты. Иногда это называют «дисбиозом», что также являет расплывчатым термином, что ограничивает его применение в клинической практике [21]. Вероятно, что такие нарушения могут играть роль в прогрессировании некоторых заболеваний, к примеру, при воспалительных заболеваниях кишечника [22, 23], но при этом такие нарушения редко бывают последовательными, а сама микробиота широко варьируется между людьми, как по отношению к здоровью, так и по отношению к заболеванию. Все это делает чрезвычайно затруднительным идентификацию конфигурации микробиоты кишечника, что требуется для специфичности и воспроизводимости, когда мы говорим о клинической практике [24]. Более того, сопоставление изменений микробиома кишечника с системными маркерами или данными сопряжено с большими трудностями. Здесь часто не учитываются такие факторы, как возраст, индекс массы тела (ИМТ), пол, применение лекарственных средств, с такими факторами, как взаимодействие между самими сообществами микроорганизмов кишечника, изменения функции иммунной системы, метаболизма, изменения физических функций в организме хозяина (Рис. 2).
Попытки определения «переломных моментов», когда изменения композиции микробиома напрямую влияют на прогрессирование заболевания, до настоящего момента не привели к точному и ясному согласию по причине несогласованности между разными исследованиями. Следовательно, мы еще далеки от утверждения, что «патобиом» играет большую роль во множестве заболеваний.
«Соотношение Firmicutes: Bacteroidetes нарушено при ожирении»
Очередное утверждение, что используется часто, но является ошибочным. Это пришло из исследований на грызунах, а также из простых, не обладающих достаточной мощностью исследований на людях. Но как в большинстве других исследований, что сообщают о связи между профилями специфической микробиоты и заболеванием, воспроизводимость мала. На сегодня есть три мета-анализа, сообщающих не только о непоследовательности результатов в исследованиях на людях, но и об отсутствии воспроизводимых микробных таксономических признаков ожирения у людей [25-27].
Это заблуждение также отражает бесполезную тенденцию изучать профили микробиоты на основе последовательностей на очень широких таксономических уровнях, таких как типы. Хотя это привлекательно с точки зрения упрощения данных, такой подход не учитывает огромную и присущую каждому типу изменчивость. Если провести грубую аналогию, то люди, птицы, рыбы, рептилии и даже морские ежи — все относятся к типу хордовых, но явно имеют очень разную физиологию, образ жизни и воздействие на окружающую среду.
Далее, это утверждение также было основано на данных о последовательностях ДНК, основанных на относительной численности. Данные о составе по-прежнему полезны и могут хорошо коррелировать с абсолютными количественными показателями, полученными с помощью таких методов, как qPCR [28,29]. Но следует принять во внимание результаты исследований, показавших, что корреляции, основанные на относительной численности, могут утратить значимость, когда в анализах также учитывается абсолютная численность микробов [9]. В дальнейшем более широкое использование абсолютных количественных данных может помочь сделать выводы, основанные на композиционном анализе, более обоснованными.
«Микробиом кишечника функционально избыточен»
Это утверждение пришло из исследований, в которых было показано, что в то время, как таксономические композиции метагеномов человека варьируются в широких пределах, функциональные профили прогнозирования генов остаются в высшей степени последовательными. Мы же утверждаем, что это, частично, артефакт, поскольку эти функциональные сравнения как правило проводятся после удаления большой пропорции метагеномных данных, которые не сопоставляются с референсными базами данных [30]. Таким образом, эти сравнительные анализы не позволяют точно охватить специализированные или менее хорошо охарактеризованные функции, а истина более тонка. Надо помнить, что существуют важные функциональные возможности, которые сохраняются у многих различных видов микробиоты человека, такие как выработка короткоцепочечных жирных кислот [29], но также существует множество ключевых функций, которые выполняются лишь относительно небольшим числом видов микробиоты. Примерами могут служить оксалат [31] и устойчивый к разложению крахмал [32]. В отсутствие ключевых видов такие функциональные возможности, как эти, не обязательно могут быть полностью заменены другими представителями микробиоты.
«Секвенирование [Sequencing] лишено предвзятости»
Несмотря на то, что методы, основанные на последовательностях (секвенирование), преобразовали исследования микробиома, эти методы не являются идеальными. Предвзятость может быть представлена на каждом шаге исследований, основанных на секвенировании, с момента сбора проб и их хранения, на каждом шаге лабораторного исследования, к примеру, при экстракции ДНК, и до выбора расходных материалов и референсных баз данных [33]. Сравнение исследований, основанных на результатах секвенирования, с исследованиями, основанными на микробиологических посевах, показало, что подходы, основанные на секвенировании, не состоятельны в отношении выявления некоторых видов, что подвергаются культивированию в традиционных методах [34]. Современные подходы, основанные на секвенировании, обладают великолепной мощностью, но их нельзя отнести к методам, лишенным предвзятости. Для оптимальной интерпретации результатов важно быть осведомленным об ограничениях, присущих этим методам.
«Нам необходима стандартизация методологий»
Это мнение очень распространено в области исследований микробиома и основано на разумном желании сделать эти исследования более простыми, а полученные в разных исследованиях результаты более надежными в отношении их сравнения. Но, как показано выше, на сегодня нет наилучшей методологии и все эти методологии в той или иной степени подвержены предвзятости. Если во всем мире все используют один и тот же метод, то из этого следует, что все одинаково слепы к ограничениям этого метода. Также существует проблема выбора, а какой именно протокол все должны применять. К примеру, сравнение результатов из «the Human Microbiome Project» с результатами проекта « MetaHIT» показало немыслимое различие в профилях микробиома и указало, что протокол « the Human Microbiome Project protocol» был намного менее эффективным при экстракции ДНК из эукариот и грамположительных бактериальных линий [35]. Правда заключается в том, что «наилучший» метод фундаментально зависит от основной структуры микробного сообщества в конкретном образце, а это может варьироваться в широких пределах от человека к человеку и между частями тела. По этим причинам мы, и не только мы, утверждаем, что оптимизация и верификация результатов, основанных на секвенировании с дополнительными подходами, предпочтительнее, чем просить всех использовать один и тот же метод. Преимуществом многогранных исследований, в которых используются различные методы и исследовательские подходы, является то, что здесь появляется возможность более механистического понимания ассоциаций между микроорганизмами и фенотипами их хозяев [37-39]. Увеличение прозрачности при сообщении о выборе методологии может стать полезным при сравнении результатов, полученных в разных исследованиях. Недавно опубликованное клиническое руководство STORMS (Strengthening the Organization and Reporting of Microbiome Studies) могло бы поспособствовать этому процессу при условии широкого применения.
«Большую часть микробиоты человека невозможно культивировать»
Внедрение высокопроизводительных технологий секвенирования уже нашло отражение в виде заявлений о том, что предпочтительнее использовать эти методы потому, что ассоциированные с человеком микроорганизмы невозможно культивировать в лаборатории. Фактически, достаточно большая доля бактерий и архей нашей микробиоты уже культивируется [41] (вирусы и грибы все еще не представлены), при этом еще в 1970-х была показана пригодность к культивированию широкого разнообразия видов, что составляют кишечную микробиоту человека [42]. При этом множество видов продолжают культивировать потому, что за последнее время лаборатории резко повысили свою эффективность [43, 44]. Это указывает на то, что текущие пробелы в сборе микробиологических посевов (культуральные исследования) частично можно объяснить недостаточными усилиями, а не «врожденной неспособностью» к культуральному исследованию. Несмотря на то, что культуральные исследования являются трудоемким процессом, имеют свои риски предвзятости и часто требуют дорогостоящего оборудования, тем не менее эти исследования имеют и свои преимущества. Сюда можно отнести возможность механистических экспериментов, верифицирование геномных прогнозов и разработка на их основе новых терапевтических подходов [45]. Принимая во внимание важность продолжения работ, в основе которых лежат микробиологические посевы, для прогресса в исследованиях микробиома, отрадно видеть, что этот миф занимает все меньшее место в работах, опубликованных в последние годы. В то же время это служит хорошим примером, как общепринятая догма просто не соответствует действительности. Все это очень хороший урок и для других мифов и заблуждений, от которых еще не отказались.
Выводы
Область исследования микробиома очень широка и здесь существует очень много спорных тем, которые также могли войти в этот обзор. Но, тем не менее, наши знания продолжают эволюционировать и мы все больше фокусируемся на концепциях, которые поддерживаются доказательствами, что позволяет нам избавляться от мифов и заблуждений. Несмотря на то, что многие из них, указанные выше, выглядят несколько тривиальными, мы утверждаем, что точность в деталях имеет очень важное значение. Если мы будем продолжать следовать мифам даже в тривиальных деталях, но насколько мы можем полагаться на нашу точность при освещении более важных вопросов? Мы надеемся, что путем показа этих нескольких мифов и заблуждений о микробиоме, мы привлечем большее внимание к потенциальным проблемам, возникающим в результате чрезмерного упрощения и недостаточно критичной оценки в литературе по микробиому.
Принимая во внимание потенциальное влияние на здоровье, огромный объем финансирования и живой интерес общественности к микробиому, отказ от необоснованных утверждений имеет решающее значение, если мы хотим избежать нецелевого расходования ресурсов на непродуктивные исследования и подрыва доверия общественности к нашим выводам.
Источник: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01426-7
Список литературы:
1. Hacker, J. & Blum-Oehler, G. In appreciation of Theodor Escherich. Nat. Rev. Microbiol. 5, 902 (2007).
2. Cruickshank, R. Bacillus bifidus: its characters and isolation from the intestine of infants. J. Hyg. 24, 241–254 (1925).
3. Metchnikoff, E. The Prolongation of Life: Optimistic Studies (William Heinemann, G. P. Putnam’s Sons, 1907).
4. Miller, I. The gut–brain axis: historical reflections. Microb. Ecol. Health Dis. 29, 1542921 (2018).
5. Roediger, W. E. W. The colonic epithelium in ulcerative colitis: an energy-deficiency disease? Lancet 316, 712–715 (1980).
6. Prescott, S. L. History of medicine: origin of the term microbiome and why it matters. Hum. Microb. J. 4, 24–25 (2017).
7. Stephen, A. M. & Cummings, J. H. The microbial contribution to human faecal mass. J. Med. Microbiol. 13, 45–56 (1980).
8. Hoyles, L. & McCartney, A. L. What do we mean when we refer to Bacteroidetes populations in the human gastrointestinal microbiota? FEMS Microbiol. Lett. 299, 175–183 (2009).
9. Vandeputte, D. et al. Quantitative microbiome profiling links gut community variation to microbial load. Nature 551, 507–511 (2017).
10. Sender, R., Fuchs, S. & Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biol. 14, e1002533 (2016).
11. Cummings, J. H., Bingham, S. A., Heaton, K. W. & Eastwood, M. A. Fecal weight, colon cancer risk, and dietary intake of nonstarch polysaccharides (dietary fiber). Gastroenterology 103, 1783–1789 (1992).
12. Cummings, J. H., Pomare, E. W., Branch, W. J., Naylor, C. P. & Macfarlane, G. T. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut 28, 1221–1227 (1987).
13. Sender, R., Fuchs, S. & Milo, R. Are we really vastly outnumbered? Revisiting the ratio of bacterial to host cells in humans. Cell 164, 337–340 (2016).
14. Ferretti, P. et al. Mother-to-infant microbial transmission from different body sites shapes the developing infant gut microbiome. Cell Host Microbe 24, 133–145.e5 (2018).
15. Valles-Colomer, M. et al. The person-to-person transmission landscape of the gut and oral microbiomes. Nature 614, 125–135 (2023).
16. Rothschild, D. et al. Environment dominates over host genetics in shaping human gut microbiota. Nature 555, 210–215 (2018).
17. Yatsunenko, T. et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature 486, 222–227 (2012).
18. Goodrich, J. K. et al. Human genetics shape the gut microbiome. Cell 159, 789–799 (2014).
19. Schäffler, H. & Breitrück, A. Clostridium difficile – from colonization to infection. Front. Microbiol. 9, 646 (2018).
20. Worby, C. J. et al. Longitudinal multi-omics analyses link gut microbiome dysbiosis with recurrent urinary tract infections in women. Nat. Microbiol. 7, 630–639 (2022).
21. Olesen, S. W. & Alm, E. J. Dysbiosis is not an answer. Nat. Microbiol. 1, 16228 (2016).
22. Ni, J., Wu, G. D., Albenberg, L. & Tomov, V. T. Gut microbiota and IBD: causation or correlation? Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 14, 573–584 (2017).
23. Pammi, M. et al. Intestinal dysbiosis in preterm infants preceding necrotizing enterocolitis: a systematic review and meta-analysis. Microbiome 5, 31 (2017).
24. Damhorst, G. L., Adelman, M. W., Woodworth, M. H. & Kraft, C. S. Current capabilities of gut microbiome-based diagnostics and the promise of clinical application. J. Infect. Dis. 223, S270–S275 (2021).
25. Finucane, M. M., Sharpton, T. J., Laurent, T. J. & Pollard, K. S. A taxonomic signature of obesity in the microbiome? Getting to the guts of the matter. PLoS ONE 9, e84689 (2014).
26. Walters, W. A., Xu, Z. & Knight, R. Meta-analyses of human gut microbes associated with obesity and IBD. FEBS Lett. 588, 4223–4233 (2014).
27. Sze, M. A. & Schloss, P. D. Looking for a signal in the noise: revisiting obesity and the microbiome. mBio 7, e01018-16 (2016).
28. Tettamanti Boshier, F. A. et al. Complementing 16S rRNA gene amplicon sequencing with total bacterial load to infer absolute species concentrations in the vaginal microbiome. mSystems 5, e00777-19 (2020).
29. Reichardt, N. et al. Specific substrate-driven changes in human faecal microbiota composition contrast with functional redundancy in short-chain fatty acid production. ISME J. 12, 610–622 (2018).
30. Méric, G., Wick, R. R., Watts, S. C., Holt, K. E. & Inouye, M.Correcting index databases improves metagenomic studies. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/712166 (2019).
31. Daniel, S. L. et al. Forty years of Oxalobacter formigenes, a gutsy oxalate-degrading specialist. Appl. Environ. Microbiol. 87, e0054421 (2021).
32. Ze, X., Duncan, S. H., Louis, P. & Flint, H. J. Ruminococcus bromii is a keystone species for the degradation of resistant starch in the human colon. ISME J. 6, 1535–1543 (2012).
33. Quince, C., Walker, A. W., Simpson, J. T., Loman, N. J. & Segata, N. Shotgun metagenomics, from sampling to analysis. Nat. Biotechnol. 35, 833–844 (2017).
34. Rajilić-Stojanović, M., Smidt, H. & de Vos, W. M. Diversity of the human gastrointestinal tract microbiota revisited. Environ. Microbiol. 9, 2125–2136 (2007).
35. Wesolowska-Andersen, A. et al. Choice of bacterial DNA extraction method from fecal material influences community structure as evaluated by metagenomic analysis. Microbiome 2, 19 (2014).
36. Munafò, M. R. & Smith, G. D. Robust research needs many lines of evidence. Nature 553, 399–401 (2018).
37. Hoyles, L. et al. Molecular phenomics and metagenomics of hepatic steatosis in non-diabetic obese women. Nat. Med. 24, 1070–1080 (2018).
38. Koh, A. et al. Microbially produced imidazole propionate impairs insulin signaling through mTORC1. Cell 175, 947–961.e17 (2018).
39. Belda, E. et al. Impairment of gut microbial biotin metabolism and host biotin status in severe obesity: effect of biotin and prebiotic supplementation on improved metabolism. Gut 71, 2463–2480 (2022).
40. Mirzayi, C. et al. Reporting guidelines for human microbiome research: the STORMS checklist. Nat. Med. 27, 1885–1892 (2021).
41. Lagkouvardos, I., Overmann, J. & Clavel, T. Cultured microbes represent a substantial fraction of the human and mouse gut microbiota. Gut Microbes 8, 493–503 (2017).
42. Moore, W. E. C. & Holdeman, L. V. Human fecal flora: the normal flora of 20 Japanese-Hawaiians. Appl. Microbiol. 27, 961–979 (1974).
43. Lagier, J. et al. Culture of previously uncultured members of the human gut microbiota by culturomics. Nat. Microbiol. 1, 16203 (2016).
44. Browne, H. P. et al. Culturing of ‘unculturable’ human microbiota reveals novel taxa and extensive sporulation. Nature 533, 543–546 (2016).
45. Walker, A. W., Duncan, S. H., Louis, P. & Flint, H. J. Phylogeny, culturing, and metagenomics of the human gut microbiota. Trends Microbiol 22, 267–274 (2014).